2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存?？鞘褂煤?20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

新鲜植物组织/培养细胞、组织

1.高速冷冻离心机
2.超速离心机
3.振荡器
4.匀浆器
5.涡旋混匀器
6.移液器
7.冰箱
8.冰盒

1.PBS缓冲液

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.超速离心管

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2.实验过程中的所有试剂须预冷：所有器具须放-20C冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3.以下步骤以细胞为例，每样约2×107个细胞。实际使用时可以等比例调整。
4.全程低温（0-4°C)：液泡膜对温度敏感，高温易破裂：

1．提取液准备：
每500μ冷的提取液A中加入1μ蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2.洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的样本，撕去表皮，取100-200mg鲜嫩植物组织样本用锋利的手术刀片切成0.5mm*0.5mm细块，加入500μl洗涤液A充分混匀。
3.在30°C条件下静置15分钟。
4.在2000xg条件下离心5分钟，弃上清，收集沉淀。
5. 在沉淀中加入500ul提取液B，充分混匀。
6.将提取液B样本悬液置振荡器上37°C或室温振荡4-24小时。
7.离心力1000xg离心5分钟，收集沉淀。
8.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
9.沉淀中加入1ml冷的提取液试剂C混匀，置冰上5分钟。转移至预冷的玻璃匀浆9器中。
10.用Dounce匀浆器匀浆。
11.收集匀浆液，在4°C，600xg条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。
12.将上清在4°C，1,000xg力条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。
13.将上清在4°C，5,000xg力条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。
将上清在4°C，20,000xg力条件下离心30分钟。收集沉淀。14.
15.在沉淀中加入500ul冷的PBS缓冲液，轻轻混匀。
16.在4°C，20,000xg力条件下离心30分钟。弃上清，收集沉淀。
17.在沉淀中加入1mL提取液C，充分混匀备用。
18.在超速离心管中依次加入2mL提取液D3-2mL提取液D2-2mL提取液D1。
19.将提取液C混合液缓慢铺在提取液D的顶层。
20.超速离心，100,000xg条件，4°C离心90-120分钟。
21.离心后，提取液D1和D2界面层处的白色浑浊带为液泡富集层。
22.用 21G针头从离心管侧壁靠近D1和D2界面层处条带处穿刺，缓慢吸出液泡组分(约1-1.5mL),置于预冷离心管中。
23.向收集的液泡组分中加入3倍体积的预冷PBS，轻轻颠倒混匀.
24.在20,000xg，4°C离心30分钟，弃上清，沉淀即为液泡。

液泡如何鉴定？
液泡可通过中性红染色鉴定：中性红可特异性积累在液泡中，在显微镜下呈红色。

样品如何保存？
保存：短期（1周）4°C冷藏；长期（数月）分装后-80°C冻存，避免反复冻融。